En la mitocondria, la energía almacenada en el NADH será utilizada para generar un gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial. Dicho gradiente de protones impulsará a su vez la síntesis de ATP.
La oxidación de la glucosa durante la glucólisis y el ciclo de Krebs, genera la reducción de coenzimas NAD+ y FAD+ a NADH y FADH 2 . Los electrones provenientes del NADH, serán transferidos a la coenzima Q, por el complejo NADH deshidrogenasa. Durante la transferencia de electrones, se genera un transporte de protones hacia el espacio intermembrana, a través de la membrana interna mitocondrial. La coenzima Q cede los electrones al complejo bc1. Durante este movimiento, más protones se desplazan desde la matriz hacia afuera de la membrana interna. Los electrones del FADH 2 también serán transferidos a la coenzima Q, mientras más protones atraviesan la membrana.
Los electrones recibidos por el complejo cit bc1, son transportados al citocromo c y éste a su vez los cede al complejo citocromo c oxidasa. Este complejo también transporta protones hacia el espacio intermembrana. Finalmente, el complejo citocromo oxidasa transfiere los electrones desde el citocromo c hacia el oxígeno, último aceptor de electrones que se reduce formando agua como producto final. Los protones transferidos y acumulados en el espacio intermembrana, generan un gradiente de protones o fuerza protón motriz. La membrana interna es impermeable a los iones, los protones pueden regresar a la matriz pasando a través de canales específicos denominados: complejos ATP sintetasa. La energía liberada durante el movimiento de retorno de protones, se utiliza para sintetizar ATP a partir de ADP y un grupo fosfato. La formación de ATP generado a partir de este mecanismo se denomina fosforilación oxidativa .