La replicación del ADN comienza en una secuencia de nucleótidos conocida como origen de replicación. La helicasa desenrolla y abre la doble hélice del ADN, mientras las proteínas estabilizadoras de cadenas simples (SSBP) se unen a las hebras desapareadas. La ADN polimerasa III es la principal enzima involucrada en la replicación del ADN. Esta enzima puede catalizar la adición de nucleótidos, solamente en el extremo 3´de una cadena pre-existente. No puede por sí sola iniciar la síntesis, por lo tanto, una ARN polimerasa denominada primasa, construye una secuencia de alrededor de 10 nucleótidos complementarios a la cadena de ADN parental. A partir del segmento de ARN o cebador, la ADN pol III adiciona desoxirribonucleótidos para sintetizar la nueva cadena de ADN complementaria al molde.
Las dos cadenas de ADN son antiparalelas, están orientadas en direcciones opuestas, por lo tanto utilizan distintos mecanismos de elongación.
La cadena lider o adelantada está bien orientada para la enzima, la que adiciona nucleótidos en el extremo 3´, el crecimiento de la cadena es contínuo.
Por el contrario, la cadena rezagada, es sintetizada discontinuamente como una serie de cortos tramos denominados fragmentos de Okazaki. Cuando la ADN pol III alcanza al cebador de la cadena rezagada, una ADN pol I remueve al cebador y lo reemplaza con un segmento de ADN. Una ADN ligasa sujeta los tramos a través de puentes fosfodiéster. A medida que el ADN se desenrolla, se sintetizan nuevos cebadores y la ADN pol III continúa la síntesis de nuevos fragmentos de Okazaki. Para simplificar, la ADN pol III ha sido representada como unidades separadas, una actúa en la cadena lider y la otra en la cadena rezagada. Las dos cadenas del ADN se sintetizan simultáneamente. La maquinaria molecular es más compleja, otras proteínas involucradas no aparecen en la animación.